Для онкологов
Как мы работаем

1. Начало исследования образца: кровь, костный мозг или MNC
2. Позитивная изоляция клеток эпителиальной опухали для клеточного применения
3. Позитивная изоляция клеток эпителиальной опухали для молекулярного применения
4. Негативная изоляция клеток эпителиальной опухали угнетением лейкоцитов
5. Добавить эпителиально обогащенный CELLection
6. Добавить эпителиально обогащенный Dynabeads
7. Добавить эпителиально обогащенный Dynabeads М-450 СD 45
8. Добавить освобождающийся буферный раствор
9. Лизис( растворение)
10. Угнетать лейкоциты
11. Жизнеспособные и без гранул (утолщений) клетки эпителиальной опухоли для культуры или окрашивания
12. RT-PCR или PCR специальные маркеры опухоли
13. Жизнеспособные нетронутые клетки опухоли для любого анализа нижнего потока.


Из всей крови мы изолируем циркулирующие клетки рака, используя градиентные решения и пористые мембраны. После этого мы продолжаем негативный отбор с использованием цитоспина с анти CD+45( эти антитела, связанные с гематологическими клетками, отделяют их от эпителиальных злокачественных клеток) и после этого мы продолжаем положительный отбор с использованием антител EpCam, которые связывают и изолируют через цитоспин эпителиальные изначальные клетки ( раковые клетки). Затем мы идентифицируем , какие злокачественные клетки мы действительно изолировали при помощи иммортализационного набора определения Oncogen. После этого мы разводим много клеточных культур в 96 ячейках и в каждую ячейку культурной среды мы добавляем различные химиотерапевтические лекарства. Фармацевтические субстанции, добавляемые в культурную среду, следующие:

  1. Цитостатик:
    Цитостатик ( препарат подавляющий размножение раковых клеток): Оксалиплатин, цисплатин, карбоплатин, циклофосфамит, ифоспамид, тропоспамит, треосульфат, мельфалан, CCNU, BCNU, ACNU, митомицин, прокарбозин, дакарбазин, блиомицин, темозоломид, истрамустин, бендамустин, доксорубицин, епирубицин, аунорубицин, дактиномицин, иринотекан, топотекан, идарубицин, етопосид, митоксандрон, паклитаксел, доцетаксел, винкристин, винбластин, , винорелбин, тауролидин, 5флюорирацил, урацил-тегафур ралтитетрексед, флоксуридин, капецитабин, метотрексат, гемцитабин, пеметрекст.

  2. Иммунологический модификатор:
    IL-2, IFN, кортизол.

  3. Ингибиторы факторов роста:
    октреотид, сульфат сурамина, сетуксимаб, ритуксимаб, транстузумаб, иматиниб месилат, коксиб, монтелеукаст, тамоксифен, ралоксифен, лепролид, анастразол

  4. Ингибиторы ангиогенеза (регенерации тканей):
    Бивацизумаб, талидомид

  5. Ингибиторы механизма сопротивления:
    Дисульфирам, верапамил, кетаконазол, 5-азацитидин.

  6. Холистические (целостные)- Альтернативные субстанции:
    Н2О2, аскорбиновая кислота, карнивора, мистетау, керцетин, индол-3-карбинол, с-статин, украин, полиMVA, коэнзим Q10, чай эсиак, модифицированный цитрусовый пиктин, IP6, пакреатиковые энзимы, салвестрол, Ункариа Томентоза, карктол, нони сок, ананасовый ацетогенин, хлорид цезия, реолизин, амигдалин -В17-, артесунат маитэйк, куркумин, экстракт зелёного чая, мелатонин, эллаговая кислота, L-метионин, N- ацетил-цестин, Ниасин (Витамин В3), L-карнитин, Витамин Е ( токоферол), супероксид дисмутаза (SOD), cелен, алоэ древовидное, IFNa2, цитозим Бовин трахея, ацеманнан, ягода акэ, порошок авемар, АНСС-активный гексо состав, серебро 32.
            Затем каждые 24 часа мы берём из каждой культуры по маленькому образцуи изолируем mРНК. Затем с RT-PCR мы производим сДНК. Потом мы следуем за микрочиповой гибридизацией и колориметрическому микрочиповому анализу с исследованием следующих генов:
            TS, DHFR, табулин а и б, коэффициент транскрипции табулина а,топоизомераз I и II (а &b), SHMT, DPD, TP, p27, p53, ДНК метилтрансфераз, О6 метилтрансфераз, ДНК диминаз, MRP (I&II), LRP, GST, VEGF, PDGF, TGFb, IGF, MMP9,ый редактаз, COX-2, 5-LOX, SS-r, c-er-B2.
            Чтобы быть более точным, синтетаза тимидилата и DHFR являются генами, которые производят очень важные энзимы(ферменты) для дорожки фолиевой кислоты. Как вам уже известно, эта дорожка является единственным биохимическим способом размножения ДНК и деления клетки. Когда раковые клетки сопротивляются антифолиатам (антифолатам) , таким как: метотрексат или 5 флюрорасил, они вытесняют эти гены и количество энзимов становится таким большим, что данный ингибитор должен иметь очень высокую концентрацию и токсичность. Также mРНК этих генов соединяется с этими энзимами и это не позволяет ингибитору с ними связаться. В добавок к этому мы должны упомянуть, что особенно для 5 FUмы проверяем выражение DPD и ТР, которое трансформирует 5-FU в 5-FUMP, активный продукт. Если активность этих генов не постоянна, то 5FU не может точно трансформироваться и, таким образом, токсины являются также очень сильными.
            Что касается поперечного связывания ДНК, перестраивающего энзимы топоизомераза I и II со всеми их изоформами, они производят энзимы, которые становятся мишенями для антрациклинов, камтотецинов, эпиподофилинов и андриамициновых структур. Эти энзимы являются важными на клеточном цикле фазы S ( в размножении ДНК) и восстановительном механизме ДНК. К сожалению, механизмы сопротивления для выше указанных ингибиторов зависит только от выражения р гликопротеиновых насосов MDR1, MRP и LRP в тканях лёгкого.
            Данные гены, которые производят табулин a и b, во всех их изоформах, являются критичными для формирования ядерной оси. Алкалоиды Винка, связанные с табулином В, подавляют формирование ядерной оси и останавливают цикл клетки на стадии метафазы. Также таксаны связывают переключатели табулина a и b и делают ядерную ось такой устойчивой, что её невозможно деполиризовать. Этим механизмом таксаны останавливают цикл клетки на стадии телофазы. К сожалению, и алкалоиды Винка и таксаны становятся целями мембрановых насосов MDR1, MRP1 и LRP или мутаций, особенно на генах табулина b , что делает молекулу не способной связываться с ингибиторами.
            Дополнительно, ДНК метилтрансфераза, О6 ацилтрансфераза и демитилаз ДНК являются генами, которые включены в метилирование ДНК и они регулируют наматывание и разматывание генов. С этими механизмами выше указанные гены регулируют выражение других генов в клетках. Особенно в раковых клетках гиперметиляция ДНК является одним из механизмов сопротивления и регуляции фенотипа рака и поведения рака. Также эти гены включены в механизм подавления алкилирующих лекарств.
            В конечном счёте гены VEGF, FGF, PDGF включены в регенерацию тканей ( ангиогенез). Как вы уже знаете ангиогенез важен для метастатической процедуры. Дополнительно к этим генам TGF, EGF, IGF и соматостатин ( соматомедин) вытесняется в раковые клетки и это провоцирует снова и снова нужные рецепторы мембраны, которые тоже вытесняются и создают механизм позитивной обратной связи клеточного роста и митотическое деление без конца и начала иммортализации. Практически вытеснение циклооксигеназа 2 и 5 липоксигеназа является критичным для этого процесса. Исследования показали, что угнетение этих энзимов ( коксибами или аналогами триена) ведет к замедлению роста раковой клетки.
            Мы также проверяем био наличие этих клеток с использованием окрашивающего вещества - Голубой Трипан 0.4% с микро-фотографиями. Голубой Трипан является наиболее надёжным методом для измерения жизненности клеточной культуры. Специалистам известно, что Голубой Трипан является уникальным аналогом аминоптерина и может участвовать в фолиевом цикле -а , химической дорожке важной и сверхактивной в раковых клетках. И это амиптерин не может пройти клеточную мембрану и поэтому он окрашивает её в голубой цвет, без окрашивания внутренней области клетки. В клетках Дебриса (мертвых клетках) он может проходить сквозь поврежденную мембрану и может окрашивать всё тело клетки в ярко синий цвет. Из 6 образцов, которые мы берём каждые шесть дней мы строим график жизнеспособности на каждое химиотерапевтическое лекарство
            Эта процедура выполняется один раз каждые 24 часа в течение 6 дней .
            Данные по микро-структурам так же как и микро-фотографии каждого случая отсылаются в нашу лабораторию и наши компьютеры их анализируют и оценивают.
    Как только мы собираем всю выше перечисленную информацию, мы разрабатываем генетический и цитологический профиль неоплазмических раковых клеток больного.
            В результате мы способны сделать заключение, какие специальные фармакологические субстанции клеток чувствительны и имеют сопротивляемость, быстро и безопасно.

Ссылки на литературу:

  • Comparison of the sulforhodamine B protein (SRB) and tetrazolium (MTT) assays for in vitro chemosensitivity testing, Keepers YP,Pizao PE,Peters GJ,van Ark-Otte J, Winograd B, Pine HM,Eur J Cancer 1991;27(12):1717
  • Profiling Novel Sulfonamide antitumor agents with cell-based phenotypic screens and array based gene expression analysis, Akira Y,Kuromitsu J,Kawai T,Nagasu T, Hata Sugi N. Yoshimatsu K, Yoshino H , Owa T, Mol cancer therapeutics, vol1,275-286, Febr 2002
  • Prediction of sensitivity of esophageal tumors to adjuvant chemotherapy by cDNA microarray analysis of gene expression profiles, Kihara C, Tsonuda T, Tanaka T, Yamana R, Hirata K, Takagi T, Nakamo Y, Cancer Res.2001 Sep 1;61(17):6474-9
  • Tetrazolium based asaays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production, DT Vistica, P Skehan, D Scudiero , A Monks , A Pittman , BR Boyd, Cancer Res Vol51, issue 10;2515-2520
  • Identification of molecular targets associated with selenium-induced growth inhibition in human breast cells using cDNA microarrays, Y Dong,H E Ganther, C Stewart, C Ip, Cancer Res, Feb 1,2002;62(3):708-714
  • Comparison of the sulforhodamine B assay and the clonogenic assay for the in vitro chemoradiation studies , Cancer chemotherapy pharmacology.2003 Mar.;51(3):221-6
  • Furukawa, T., Kubota, T., Tanino, H., Oura, S., Yuasa, S., Murate, H., Morita, K., Kozakai, K., Yano, T., and Hoffman, R.M. Chemosensitivity of breast cancer lymph node metastasis compared to the primary tumor from individual patients tested in the histoculture drug response assay. Anticancer Research 20, 3657-3658, 2000.
  • Hoffman, R.M. The clinical benefit of the histoculture drug response assay. Jpn. J. Cancer Chemother 27, Supplement 11, 321-322, 2000.
  • Hoffman, R.M. Taking chemotherapy from random to rational with the histoculture drug response assay. Jpn. J. Cancer Chemother. 24, 206-229, 1997
  • Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R.M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research 1, 305-311, 1995.
  • Robbins, T., Connors, K.M., Storniolo, A.M., Hanchett, C., and Hoffman, R.M. Sponge-gel supported histoculture drug-response assay for head and neck cancer: Correlations with clinical response to cisplatin. Arch. Otol. Head & Neck Surg. 120, 288-292, 1994. Bosanquet AG. Correlations between therapeutic response of leukaemias and an in-vitro drug-sensitivity assay. Lancet 1991; 337: 711-714.
  • Hinkley HJ, Bosanquet AG. The in vitro radiosensitivity of lymphocytes from chronic lymphocytic leukaemia using the differential staining cytotoxicity (DiSC) assay.I--Investigation of the method. International Journal of Radiation Biology 1992; 61: 103-110.
  • Hinkley HJ, Bosanquet AG. The in vitro radiosensitivity of lymphocytes from chronic lymphocytic leukaemia using the differential staining cytotoxicity (DiSC) assay. II--Results on 40 patients. International Journal of Radiation Biology 1992; 61: 111-121.
  • Bosanquet AG. The DiSC assay 10 years and 2000 tests further on. In: Kaspers GJL, Pieters R, Twentyman PR, Weisenthal LM, Veerman AJP (Eds) "Drug resistance in leukemia and lymphoma. The clinical value of laboratory studies". London: Harwood 1993; 373-384.
  • Bosanquet AG, Bell PB. Handling requirements to achieve active drugs in in_vitro drug sensitivity and resistance assays. In: Kaspers GJL, Pieters R, Twentyman PR,Weisenthal LM, Veerman AJP (Eds) "Drug resistance in leukemia and lymphoma. The clinical value of laboratory studies." London: Harwood 1993; 227-255.
  • Bosanquet AG. In vitro drug sensitivity testing for the individual patient - an ideal adjunct to current methods of treatment choice. Clinical Oncology 1993; 5: 195-197. (Editorial)
  • Fruehauf JP, Bosanquet AG. In vitro determination of drug response: A discussion of clinical applications. In: Cancer, Principals and Practice of Oncology, PPO updates.Eds. DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA. Philadelphia: Lippincott 1993; 7(12): 1-16. (Review)
  • Bosanquet AG. Short-term in vitro drug sensitivity tests for cancer chemotherapy. A summary of correlations of test result with both patient response and survival. Forum Trends Experimental and Clinical Medicine 1994; 4: 179-195. (Review)
  • Bosanquet AG, McCann SR, Crotty GM, Mills MJ, Catovsky D. Methylprednisolone in advanced chronic lymphocytic leukaemia: rationale for, and effectiveness of treatment suggested by DiSC assay. Acta Haematologica 1995; 93: 73-79.
  • Bosanquet AG, Bell PB. Enhanced ex vivo drug sensitivity testing of chronic lymphocytic leukaemia using refined DiSC assay methodology. Leukemia Research 1996; 20: 143-153.
  • Bosanquet AG, Bell PB. Novel ex vivo analysis of nonclassical, pleiotropic drug resistance and collateral sensitivity induced by therapy provides a rationale for treatment strategies in CLL. Blood 1996; 87: 1962-1971.
  • Bosanquet AG. Ex vivo Phase II trials and cross resistance with lithium gamma-linolenic acid. Annals of Oncology 1996; 7 (Suppl 1): 33. (Abstract)